Ключевые соображения по разработке протоколов исследования очистки от вирусов продуктов генной терапии

ICH Q5A(R2)-Международный фонд гармонизации

ICH Q5A(R2) был официально принят 1 ноября 2023 г. и представляет собой основной международный руководящий документ по оценке вирусной безопасности. По сравнению с Q5A(R1), опубликованным в 1999 году, существенные обновления версии R2 включают: новую добавленную главу об оценке вирусной безопасности при непрерывном производстве (глава 7); усиленная роль оценки риска как основы стратегий очистки от вирусов; включение секвенирования следующего-поколения (NGS) при обнаружении вирусов; и четкие требования к оценке новых продуктов и производственных процессов. Q5A(R2) был принят регулирующими органами, включая FDA, EMA и PMDA, обеспечивая единую техническую основу для проверки очистки от вирусов во всем мире.

NMPA-Китайская система регулирования

Нормативная база NMPA по вирусной безопасности охватывает несколько уровней:

Уровень документа	Название документа	Год выпуска
Основополагающий документ	Технические рекомендации по удалению/инактивации вирусов из продуктов крови	2002
Основополагающий документ	Общие принципы технического анализа оценки вирусной безопасности продуктов биологических тканей-производных и продуктов, экспрессируемых эукариотическими клетками-	2005
Руководство по-конкретному продукту	Технические рекомендации по фармацевтическим исследованиям и оценке применения в клинических испытаниях продуктов генной терапии на основе рекомбинантного адено-ассоциированного вируса (rAAV)-in vivo	2023
Руководство по-конкретному продукту	Общие технические требования к фармацевтическому качеству вектора рекомбинантного адено-ассоциированного вируса (rAAV)-на основе продуктов генной терапии in vivo для заявок на получение регистрационного удостоверения	2025
Инновационное руководство	Технические рекомендации по валидации платформы процессов очистки от вирусов для клинических испытаний терапевтических рекомбинантных белковых продуктов (испытание)a	2024

а: Данное руководство представляет собой первый случай, когда регулирующий орган Китая установил систематические технические требования к валидации платформ и процессов очистки от вирусов и соответствует духу ICH Q5A(R2).

FDA и EMA-Нормативные требования США и Европы

В январе 2024 года FDA официально выпустило отраслевое руководство на основе ICH Q5A(R2). Кроме того, глава Фармакопеи США (USP)<1050.1>предоставляет дополнительное техническое руководство по разработке, оценке и характеристике процедур очистки от вирусов. FDA организует симпозиум по очистке от вирусов каждые два года; На симпозиуме 2023 года были рассмотрены такие новейшие темы, как новые методы, непрерывное производство, новые хроматографические среды и адсорбционные фильтры. Основные руководящие документы EMA включают CPMP/BWP/268/95 (Примечание к руководству по исследованиям по проверке вирусов: дизайн, участие и интерпретация исследований, подтверждающих инактивацию и удаление вирусов) и EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 (Руководство по оценке вирусной безопасности биотехнологических исследуемых лекарственных препаратов), оба из которых были согласован с ICH Q5A(R2).

Идентификация источников вирусного заражения

ICH Q5A(R2) подчеркивает, что дизайн проверки очистки от вируса должен основываться на комплексной оценке риска. Для продуктов генной терапии идентификация источников вирусного загрязнения должна охватывать следующие уровни:

Уровень банка клеток: эндогенные вирусы (например, ретровирусные частицы) и латентно инфекционные вирусы, потенциально содержащиеся в субстратах продуцирующих клеток (например, HEK293, CHO, HeLa). Известно, что клетки HEK293 содержат эндогенные последовательности Ad5 E1 и фрагмент EBV размером примерно 900 п.н. и способны экспрессировать репликационно компетентный аденовирус; поэтому при оценке риска этому риску следует уделять особое внимание.

Уровень хелперного вируса: для производства вектора AAV обычно используются такие методы, как тройная трансфекция с использованием хелперных плазмид, которые несут риск образования репликационно-компетентного аденовируса (RCA). Аналогично, упаковочные клетки, используемые при производстве лентивирусных векторов, могут генерировать репликационно компетентный лентивирус (RCL).

Уровень сырья: Случайные вирусы могут быть занесены через сырье, используемое в производстве, включая среды для культивирования клеток, корма и ферменты. Этот риск особенно значителен при использовании компонентов-животного происхождения (например, эмбриональной бычьей сыворотки, растворов гидролизата трипсина).

Различия в рисках: генная терапия и традиционные рекомбинантные белки

Измерение риска	Традиционные рекомбинантные белковые продукты	Продукты генной терапии
Вирусный источник	Эндогенные вирусы из банка клеток; случайные вирусы	Вирусы клеточного банка; вирусы-помощники; репликационно--компетентные векторы (RCV/RCL); интеграция генома хозяина
Клеточный субстрат	CHO, NS0, Sp2/0 и другие хорошо-охарактеризованные клеточные линии.	HEK293, HeLa, CHO и т. д.; некоторые клеточные линии имеют онкогенное происхождение
Характеристики продукта	препарат на белковой-основе; четко-определенная структура	Вирусный вектор; представляет угрозу биобезопасности
Стратегия проверки	Многоэтапное-очистка от вирусов; акцент на валидации этапов процесса	Требуется обнаружение RCV/RCL; валидация и тестирование необходимы
Проверка платформы	Применимо к устоявшимся процессам, таким как S/D, низкий уровень pH, нанофильтрация.	Ограниченная применимость из-за разнообразия типов векторов.

Таблица 1. Сравнение рисков вирусной безопасности: продукты генной терапии и традиционные продукты рекомбинантных белков

Общие принципы

Выбор индикаторного вируса является центральным элементом разработки протоколов проверки очистки от вирусов. ICH Q5A(R2) требует, чтобы выбор индикаторного вируса основывался на оценке риска и учитывал следующие факторы:

Соответствие вируса субстрату продуцирующих клеток (соответствующий вирус)

Физико-химические свойства вируса (с оболочкой/без-оболочки, ДНК/РНК, диапазон размеров)

Устойчивость вируса к физическому/химическому лечению.

Обнаруживаемость и биобезопасность вируса

Для продуктов генной терапии при выборе индикаторного вируса необходимо дополнительно учитывать: роль самого векторного вируса как «релевантного вируса»; потенциальный риск заражения вирусом-помощником; а также требования к обнаружению и проверке вирусов, способных к репликации-(RCV/RCL).

Рекомендуемый индикатор панели вирусов

Вирус	Тип	Конверт	Геном	Размер (нм)	Обоснование выбора/применение
МВМ	парвовирус	Никто	оцДНК	18–26	Модель без-конверта; наименьший размер и высочайшее сопротивление; подходит для проверки нанофильтрации (как правило, не применимо для векторных продуктов rAAV)
ППВ	парвовирус	Никто	оцДНК	18–26	Модель без-конверта; широко используемый индикаторный вирус для продуктов крови
Рео-3	Реовирус	Никто	дсРНК	60–80	Модель без-конверта; средний размер; высокая физическая стабильность
ПРВ	Герпесвирусы	Да	дцДНК	150–200	Конвертированная модель; большой размер; широкий диапазон хостов
X-мультивольт	Ретровирус	Да	оцРНК	80–110	Оболочечная модель ретровируса; подходит для клеточных субстратов, полученных из CHO-
БВДВ	Флавивирусиды	Да	оцРНК	40–60	Конвертированная модель; используется для оценки методов химической инактивации (суррогат ВГС)
ВСВ	Рабдовирусиды	Да	оцРНК	70	Конвертированная модель; широкая толерантность к pH; подходит для проверки инактивации при низком-pH

Таблица 2. Рекомендуемая панель индикаторных вирусов для проверки очистки от вирусов продуктов генной терапии

Особые соображения по продуктам AAV Vector

Что касается рекомбинантных векторных продуктов AAV, Технические рекомендации NMPA по фармацевтическим исследованиям и оценке применения в клинических испытаниях продуктов для генной терапии на основе вектора rAAV-in vivo требуют внимания к обнаружению репликационно--компетентного AAV (rcAAV). rcAAV относится к AAV, способному к автономной репликации, которая обычно возникает в результате гомологичной рекомбинации между хелперной плазмидой и геномом продукта AAV. Обнаружение rcAAV обычно проводят с помощью инфекционных анализов или методов количественной ПЦР, проводимых отдельно на лекарственном веществе и очищенном продукте.

Стоит отметить, что последующие процессы очистки векторных продуктов AAV обычно включают расщепление нуклеазой, хроматографию (AEX), нанофильтрацию и ионообменную хроматографию (CEX/IEX). При традиционной проверке очистки от вируса эти этапы процесса могут привести к значительным потерям самого вектора AAV; поэтому при разработке модели-уменьшения необходимо тщательно учитывать взаимодействие между вирусами-переносчиками и вирусами-индикаторами. Для определенных этапов процесса (например, нанофильтрации), где потери вектора AAV значительны, следует оценить, оправданы ли корректировки процесса на основе данных проверки (например, корректировка размера пор мембраны для нанофильтрации).

Общие принципы

Модель-уменьшения масштаба (SDM) – это основной инструмент проверки отсутствия вирусов; его конструкция должна точно отражать эффективность производственного процесса по очистке от вирусов. ICH Q5A(R2), раздел 6.2.2, прямо требует, чтобы модель масштабирования-уменьшения сохраняла согласованность с производственным процессом по ключевым параметрам. Для продуктов генной терапии при разработке SDM особенно важны следующие соображения:

Репрезентативность критических параметров процесса

Модель масштабирования-уменьшения должна соответствовать производственному процессу по следующим параметрам: хроматографические условия (состав буфера, pH, проводимость); коэффициент загрузки (массовое соотношение вектор/супернатантный белок); время контакта и температура; скорость потока/время пребывания; чистота и состав продукта. Для продуктов AAV также следует отдельно учитывать влияние распределения векторных частиц по размерам и содержания пустого капсида на эффективность нанофильтрации.

Квалификационные требования модели

ICH Q5A(R2) требует адекватной квалификации масштабируемой-модели, включая: сравнение показателей качества продукции (например, чистота, извлечение, плотность); квалификация согласованности критических параметров процесса; и обеспечение того, чтобы масштабируемая-модель учитывала изменчивость производственного процесса. На этапах хроматографии необходимо оценить постоянство профиля пиков, элюирования и промывки; для стадий нанофильтрации необходимо проверить влияние объемной емкости и состава продукта.

Формула расчета LRV

Логарифм снижения (LRV) является основным показателем для измерения эффективности удаления вируса. ICH Q5A(R2), раздел 6.5, содержит подробное описание методов расчета LRV и статистической обработки. Основная формула расчета LRV: LRV=log₁₀(N₀/N), где N₀ — начальный титр вируса после введения вируса, а N — остаточный титр вируса после технологической обработки. Если титр остаточного вируса падает ниже предела обнаружения анализа, следует использовать такие методы оценки, как распределение Пуассона (например, тестирование в больших-объемах).

Применение доверительных интервалов

Как ICH Q5A(R2), так и EMA CPMP/BWP/268/95 требуют оценки доверительного интервала результатов расчета LRV. Обычно применяется доверительный интервал 95%.

Критерии эффективности

В соответствии с Техническим руководством NMPA по удалению/инактивации вирусов из продуктов крови снижение количества вирусов, превышающее или равное 4 логарифмам, указывает на то, что данный этап процесса эффективен для удаления/инактивации вируса. Однако этот критерий не является абсолютным пороговым значением и должен оцениваться комплексно вместе с кривыми кинетики инактивации, научным обоснованием выбора индикаторного вируса и общей надежностью конструкции протокола валидации. Для продуктов генной терапии особое внимание следует уделять совокупной способности очистки на всех этапах процесса, чтобы гарантировать, что общий профиль вирусной безопасности находится на приемлемом уровне.

Применение и проблемы нанофильтрации

Удерживающая вирус-фильтрация (нанофильтрация) — это важнейший этап очистки от вирусов при последующей очистке продуктов генной терапии. Типичные фильтры,-задерживающие вирусы, имеют размер пор примерно 20 нм. Механизм очистки вирусов при нанофильтрации основан, главным образом, на-исключении вирусов, и он может эффективно удалять большинство вирусов, размер которых превышает размер пор мембраны, включая небольшие парвовирусы без-оболочки, такие как MVM и PPV.

Однако нанофильтрация продуктов генной терапии сталкивается с уникальными проблемами: размер векторов AAV (приблизительно 20–26 нм) аналогичен размеру некоторых индикаторных вирусов (например, MVM, 18–26 нм), что может приводить к снижению восстановления вектора; пустые капсиды могут влиять на поток фильтрации и эффективность удержания вируса; вязкость образца может значительно увеличиваться с увеличением концентрации вектора. Таким образом, дизайн SDM для проверки нанофильтрации должен полностью учитывать влияние распределения векторных частиц по размерам и содержания пустого капсида на производительность фильтрации, и следует уделить внимание использованию нанофильтрационных мембран с большими размерами пор, если это целесообразно.

Оценка вирусной очистки на этапах хроматографии

Ионообменная хроматография (IEX) является основным этапом в процессах очистки продукта AAV, обычно с использованием нуклеазного расщепления с последующей анионообменной хроматографией (AEX) для улавливания пустых и дефектных капсидов или катионообменной хроматографии (CEX) для тонкой очистки полных капсидов. Механизмы удаления вируса на этапах хроматографии включают исключение размера, электростатические взаимодействия, аффинные взаимодействия и другие факторы. Обсуждения на симпозиуме FDA по очистке от вирусов 2023 года показали, что эффективность очистки от вирусов на этапах хроматографии зависит от множества факторов, включая нагрузочную способность, pH, проводимость и круговорот смолы; Для комплексной оценки следует использовать многофакторный ортогональный подход к проектированию.

Контроль вирусной безопасности в непрерывном производстве

Недавно добавленная глава 7 ICH Q5A(R2) устанавливает конкретные требования к оценке вирусной безопасности при непрерывном производстве. Для продуктов генной терапии непрерывное производство стало важным направлением развития, но оно также создает новые проблемы вирусной безопасности. Стратегии контроля вирусной безопасности при непрерывном производстве включают: встроенные фильтры для защиты от вирусов в качестве важнейших мер сдерживания; соответствующий расчет времени пребывания и технологических потоков; включение этапов инактивации с определенным временем выдержки; и расширенное применение технологии анализа процессов (PAT) для мониторинга критических параметров процесса в-режиме реального времени.